Meridian 的 Air-Dryable™ Direct DNA 和 RNA/DNA qPCR 尿液母液混合物
- 使用粗尿样创建超灵敏的多重直接定量 PCR 尿液检验。
- 简化 qPCR 尿液检测，去除核酸提取步骤或纯化过程中的抑制剂携带，缩短样品到结果的时间，提高可重复性。
- 专为直接检测极低滴度的细菌和无细胞核酸而设计。
- 可湿用，也可烘干，用于开发环境温度稳定的检测方法。
在含有 5%人体尿液的情况下仍具有很高的性能（灵敏度和重现性
将风干的Air-Dryable™Direct RNA/DNA qPCR 尿液（红色）与 Reliance 1-Step Multiplex RT-qPCR Supermix（紫色）的活性进行比较，看它们在 5%人体尿液中扩增 1,000 倍稀释的 RNA 目标物（分别为 10,000 和 10 个拷贝）的能力。结果表明，干燥混合物与液体混合物保持了相同的高性能，并且灵敏度远高于 Reliance 1-Step Multiplex RT-qPCR Supermix。
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说明
尿液是一种理想的临床标本，因为它能大量排出体外，无创伤，而且可以自行取样。目前，尿液标本被用于诊断和治疗传染病（包括性传播疾病）、激素和代谢紊乱、肾脏疾病、膀胱癌、尿路感染（UTI）以及监测娱乐性药物的使用。然而，尿液中含有尿素和核酸酶等物质，会损伤 DNA 或抑制 PCR 反应。
Meridian 的新型Air-Dryable™Direct Urine 分子混合物非常独特，可以直接从高浓度尿液中高灵敏、快速地检测目标 DNA 或 RNA，其灵敏度足以检测基孔肯雅病毒等虫媒病毒。这些混合物是专门为克服尿液中的抑制剂而配制的，除了添加引物和探针外，无需进一步优化。此外，这些混合物既可以湿法使用，也可以通过烘箱或风干法干燥，以建立环境温度稳定的检测方法。
规格
| 产品描述 | 不含甘油的 qPCR 和 RT-qPCR 混合液，含有 Taq 聚合酶、逆转录酶、反应缓冲液、dNTPs、MgCl2 和风干兼容辅料，可耐受尿样中存在的抑制剂的影响。 |
| 浓度 | 4x |
| 外观 | 无色透明溶液 |
| 热启动 | 抗体介导 |
| 应用 | 基于探针的实时 PCR、两步式 RT-qPCR、一步式 RT-qPCR |
| 样品类型 | 来自人体粪便的 cDNA、粗制或纯化 RNA 和/或 DNA |
| 演示文稿 | 1 瓶 |
| 存储 | -20 °C |
| 混合稳定性 | 见外标签 |
| 化验稳定性 | 在环境温度下风干后可保存 24 个月。 |
| 一致性 | 测试样本和参照样本之间的 ± 0.5 Ct 差异 |
| DNase/RNase 污染 | 未检测到降解 |
目录和手册
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常见问题：qPCR 尿液检测
与其他样本类型相比，使用尿液有什么优势？
定量 PCR 尿液检测的优点是完全无创，可自行大量取样。尿液检测可用于诊断和治疗传染病（包括性传播疾病）、激素和代谢紊乱、肾脏疾病、膀胱癌、尿路感染（UTI）以及监测娱乐性药物的使用。
尿液能检测出哪些类型的传染病？
最常见的感染是尿路感染（UTI），最常见的是大肠埃希菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌、溶血性葡萄球菌和肺炎克雷伯菌。尿 DNA 和尿 RNA 检测还可诊断其他一些感染，包括社区获得性肺炎（CAP）、军团菌病、结核病、先天性巨细胞病毒（CMV）感染以及虫媒病毒，如基孔肯雅病毒、登革热病毒和寨卡病毒。寄生虫也可通过尿液检测来诊断，以检测血吸虫的虫卵。此外，尿液还可用于筛查各种性传播疾病（STD），如淋病奈瑟菌和沙眼衣原体。
从尿液中可以检测出哪种癌症？
癌细胞或其 DNA 或 RNA 过大，无法通过肾脏，只能从膀胱或输尿管排出，因此膀胱癌是最明显的尿癌，但前列腺癌和宫颈癌也能检测到。
尿液定量 PCR 检测中最多可使用多少尿量？
我们在混合液中使用了高达 25% 的人尿。
混合料干燥后多久可以稳定使用？还是需要在干燥后立即使用？
如果正确存放在密封袋中，它在环境温度下的稳定性可达 2 年。
如果要检测尿液中的细菌，是否需要预处理？
这取决于细菌的情况，对于某些细菌，你可能不需要做任何预处理，但有些细菌可能需要加热到 95°C 5 分钟，对于某些较难处理的细菌，可能需要蛋白酶 K 步骤（蛋白酶 K 55°C 15 分钟，然后在 98°C 5 分钟）或使用非离子去污剂（如吐温-20，最终浓度为 0.2%，然后在室温下孵育 10 分钟）。
使用 DNA 专用尿液混合物与 DNA/RNA 尿液混合物时，DNA 的性能有何不同？
我们没有发现这两种混合物之间存在性能差异，因此我们将 Air-Dryable Direct RT-qPCR 尿液混合物称为 Air-Dryable™ Direct RNA/DNA qPCR 尿液混合物，因为它可同时用于两种用途。
风干混合物和液体混合物的反应条件是否相同？
是的，Air-Dryable™ Direct DNA qPCR 尿液和 Air-Dryable™ Direct RNA/DNA qPCR 尿液可作为液体混合物使用，也可风干/烘干后储存长达 24 个月，无需改变反应条件，风干/常温储存不会影响检测灵敏度。
常见问题：风干分子检测的重要原则
我可以使用 Lyo-Ready 混合料进行风干吗？
不，风干需要特定的稳定剂、辅料和防腐剂，与冻干所需的不同。
是否可以调节烘箱温度，高温是否会损坏聚合酶或反转录酶？
是的，我们建议针对每种新的检测配方（包括引物和探针在内的混合物）、所用容器和批量大小优化烘箱温度和干燥时间。干燥温度过高可能会影响混合液及其成分（包括酶）的完整性。
如何知道干燥是否完成？
理想情况下，应从 Air-Dryable™ 1-step RT-qPCR 混合液 (MDX095) 中去除 70% 的水分，从 Air-Dryable™ 混合液 (MDX082) 中去除 95% 的水分。然而，最佳水分损失需要针对每种检测进行优化。水分保留过多可能会影响化验的保质期，而过度干燥则会使混合物难以复水并导致性能下降。水分损失可通过比较容器中初始湿混合物与干混合物的重量来计算（更多信息请参阅基本工作流程）。请注意，风干物料必须在干燥循环后立即包装。
给风干的混合物补水容易吗？是否需要涡流？
加入样本后，风干的混合液会在几秒钟内重新水化。我们建议在可能的情况下，在进行反应前轻轻摇晃/混合容器，使反应混合物重新悬浮，或者在加入病人样本时混合溶液。
在比较再水化干混料和湿混料的性能时，为什么有时会看到较低的 Ct 值？
如果混合物过度干燥，酶的完整性就会受到影响。从概念上讲，混合物的理想 “干燥度 “是在不损失检测性能的情况下达到的最高水分损失百分比。如果干混合物的 Ct 值低于可比较的湿混合物，则说明混合物已过度干燥，需要进一步优化。
不同的探针是否会影响混合液风干后的检测性能？
我们没有观察到荧光团类型（Cy5、FAM、JOE 或 ROX）对风干后混合物的性能有任何影响。
烤箱中风扇的空气循环是否会造成污染？
我们在风干过程中没有观察到任何污染，但我们建议采用良好的实验室清洁方法，以尽量减少可能的环境污染。例如，进行表面清洁或为烘箱干燥、qPCR 反应设置和分析分配单独的位置。此外，我们还建议按照制造商提供的清洁说明维护烘箱。
风扇空气会不会在干燥过程中将一个试管中的底漆/探针痕迹带到另一个试管中？
我们没有观察到风扇强制烘箱干燥过程中的任何交叉污染。由于混合液位于容器底部，因此孔与孔之间不太可能发生交叉污染。此外，根据良好生产规范，我们不鼓励在同一烘干周期内对两种不同类型的化验进行烘干。
必须使用 8 孔 PCR 管条吗？
也可以使用其他容器，如平板、小瓶或各种微芯片，但每个容器/测定的干燥条件都需要优化。一旦确定了理想的条件和参数，就需要在验证和放大过程中进行验证。
您有推荐的烤箱清单吗？
我们建议使用具有对流、风扇或真空功能的精密干燥箱（温度均匀度为 +/- 1.5°C）。在测试中，我们使用的是 Memmert UF260Plus 烤箱，风扇和气门设置分别为 100% 和 20%。请注意，不同的烤箱会有不同的规格和可调参数，需要根据您的测定、反应体积、容器类型、批量大小、相对湿度和海拔高度进行优化。
如果水分损失不足，我是否可以将试管放回烤箱中进行更长时间的培养，或者如果水分损失过多，是否可以加水？
如果第一次尝试不成功，没有提供正确的失水值，我们不建议将试管放回烘箱中继续干燥或加水。我们建议重新开始实验，以便控制所有变量，使其具有可重复性。此外，我们也不建议在干燥过程中打开炉门，除非是以可控的方式打开，并将其作为今后工序的一部分。
干燥箱所在环境湿度和温度的波动是否会影响干燥协议，从而导致水分损失超出 70% 的范围？
与冻干的效果不同，风干对水分损失没有环境影响。
能否在同一干燥循环中使用不同类型的容器和/或不同的反应体积进行测试？
我们建议执行不同的干燥周期，以测试改变容器类型、反应体积、引物/探针和批量大小等任何检测变量的效果。这将确保条件和结果的可重复性。
天平是否需要放在烤箱旁边以便快速称量？
不，天平不一定要放在烤箱旁边，只需将容器从烤箱中取出后关上，然后到天平前（即使在不同的房间）进行测量即可。
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