高保真 Pfu

PCR 用于扩增新一代测序 (NGS) 文库。除了增加 DNA 的数量外,PCR 扩增步骤还用于富集两端连接适配体的 DNA 目标片段。这些片段将附着在流式细胞上并进行测序,因此 PCR 扩增步骤不能给 NGS 文库带来突变,这一点非常重要,因为错误率越低,所需的序列覆盖范围就越小,从而节省了费用和时间。

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Meridian 的高保真 Pfu

NGS 文库扩增

使用大肠杆菌 DNA 创建了四个 NGS 文库。这些文库使用高保真 Pfu 进行扩增,然后放入流动池进行测序。图中显示了每个样本的唯一映射(只映射到参考序列上的一个位置)、模糊映射和未映射读数占样本读数总数的比例。结果表明,在使用大肠杆菌 DNA 时,高保真 Pfu 允许 90% 以上的唯一读数与参考序列进行比对,因此这些文库被认为是非常好的文库。

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Application: Specimen Type: Concentration: High Concentration: NoWet: No
Glycerol-Free: NoLyo-Ready: Air-Dryable: Dryable: Sustainability:

说明

高保真 Pfu 是一种可恒温的高保真 DNA 聚合酶,从怒火热球菌(Pyrococcus furiosus)中分离出来。Pfu 聚合酶在镁存在的情况下按 5´→3´ 方向复制 DNA,但也具有 3´→5´ 外切酶(校对)活性。在聚合过程中可能出现的碱基错接会被这种校对活性迅速切除。High-Fidelity 的错误率为 3.0 x 10-6,可产生长达 5 kb 的钝头扩增子。

规格

说明高保真热启动 Taq DNA 聚合酶与单独的 10 倍 Pfu 反应缓冲液和MgCl2
浓度2 U/µL
外观无色透明溶液
热启动抗体介导
应用PCR、NGS 文库制备、克隆、蛋白质表达
样品类型cDNA, DNA
演示文稿3 瓶
存储-20 °C
混合稳定性见外标签
一致性测试样本和参照样本之间的 ± 0.5 Ct 差异
DNA 污染在大肠杆菌和小鼠基因组 DNA 特异性目标的 PCR 扩增中未检测到与阴性对照重叠的痕迹。
DNase 污染检测不到降解

目录和手册

分子诊断试剂解决方案
分子诊断试剂溶液
目录
高特异性 Pfu HS 混合物
高特异性 Pfu HS
目录
新一代测序 (NGS)
新一代测序 (NGS)
目录

常见问题:高保真 Pfu

什么是校对聚合酶?

在自然界中,DNA 聚合酶纠正正在延伸的 DNA 链中核苷酸错位的能力往往对宿主生物的生存至关重要。这种能力被称为 “校对活动”,发生在 3′到 5′方向。这种活动也会导致聚合酶去除 3’end 处悬空的未配对核苷酸(A-overhangs),形成钝末端。

如果可能的话,我们建议对受影响的样本进行额外的清理,或者建议使用高特异性 Pfu HS 混合液(MDX006),因为它可以在存在抑制剂的情况下工作。

经过验证,高保真 Pfu 可用于 5 kb 以下的模板。

DNA 目标富集是测序前的 DNA 准备步骤,在这一步骤中,DNA 序列会被直接扩增(基于多重 PCR)或捕获(基于混合捕获)。这些富集的 DNA 片段随后可使用 DNA 测序仪进行测序。

在室温下进行 PCR 扩增设置时,标准聚合酶会有一定的活性。使用热启动聚合酶时,这种酶在室温下没有活性,从而降低了反应中因这些错误引物寡核苷酸而产生非特异性产物的风险。这一特点使这种聚合酶非常适合高通量应用,因为在这种应用中,反应可能会在室温下放置很长时间。

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