Meridian 的 Lyo-Ready dUTP 1 步 RT-qPCR 基质混合液
- 反应动力学速度极快--非常适用于多重一步法 RT-qPCR 检测和低拷贝数目标。
- 不含甘油的混合物预配有专门的冻干辅料混合物，可冻干成珠状或饼状。
- 混合液可以冻干，以进行快速、高重复性、环境温度稳定的分子诊断检测。
- 防止携带 qPCR 污染。
DNA 模板（红色）和 RNA 模板（蓝色）的高效率和高灵敏度
在一次多重 RT-qPCR 检测中，从灭活的粗病毒裂解液中扩增轮状病毒 A（dsRNA）和腺病毒（dsDNA）。结果表明，DNA 和 RNA 病毒的扩增效率和灵敏度都很高，证明 Lyo-Ready 1-Step RT-qPCR Virus Mix 有能力从单一样品中同时检测低拷贝数的 RNA 和 DNA 目标物。
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说明
分子诊断检测正逐步转向冻干格式。这样做有几个好处，包括常温运输和储存、延长保质期、减少操作步骤和潜在错误以及增加样品量的灵活性。不过，为了与干燥兼容，酶制剂必须不含甘油，并含有专门的辅料，以便在混合物暴露于冷冻、真空和脱水等各种条件时对其进行保存。
Lyo-Ready dUTP 1-Step RT-qPCR Mix 是一种 2x RT-qPCR 混合母液，可用于开发基于 RNA 的分子诊断检测，它包含单独的 lyo 兼容 MMLV-RT 和酶稀释缓冲液。dNTPs 中的 dTTP 已被 dUTP 取代，因此可加入尿嘧啶 DNA 糖基化酶（UDGase）（MDX054）以去除背景 PCR 产物污染。这使得 Lyo-Ready dUTP 1-Step RT-qPCR Mix 成为开发高灵敏度 RT-qPCR 诊断测试（如检测极低水平的 RNA 病毒）的理想选择。
规格
| 说明 | 不含甘油的混合母液，含有 Taq 聚合酶、RNase 抑制剂、反应缓冲液、dNTP/dUTP 混合液、MgCl2 和溶菌酶，以及单独的反转录酶和稀释缓冲液，用于去除背景 PCR 产物污染。 |
| 浓度 | 2x |
| 产品规格 | 无色透明溶液 |
| 热启动 | 抗体介导 |
| 应用 | 高通量、qPCR、两步 RT-qPCR |
| 样品类型 | cDNA, DNA |
| 演示文稿 | 3 瓶 |
| 存储 | -20 °C |
| 混合稳定性 | 见外标签 |
| 检测稳定性 | 冻干后在环境温度下可保存 24 个月 |
| 一致性 | 测试样本和参照样本之间的 ±0.5 Ct 差异 |
| DNA 污染 | 在大肠杆菌和小鼠基因组 DNA 特异性目标的 PCR 扩增中未检测到与阴性对照重叠的痕迹。 |
| DNase 污染 | 检测不到降解 |
目录和手册
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常见问题：Lyo-Ready qPCR 和 RT-qPCR 母液混合物
什么是一步式 RT-qPCR 和两步式 qPCR？
在一步式 RT-qPCR 或反转录 qPCR 中，cDNA 合成和 qPCR 在一个反应管中进行。在两步式 qPCR 中，cDNA 在一个反应管中合成，然后将等分的 cDNA 用于随后的 qPCR 实验。
使用一步式 RT-PCR 混合液有哪些优势？
– 准确反映目标拷贝数
– 简单快速
– 移液步骤更少（减少可能出现的错误和污染）
– 高通量筛选的最佳选择
– 只需重复运行几项检测时的最佳方法
– 可在单孔中使用同一 RNA 样品对相关基因和对照进行多重 qPCR 检测
一步法反应还有其他一些优点，包括样品处理有限和减少工作台时间，这有助于减少反转录和 qPCR 步骤之间的移液错误和交叉污染。这种方法设置快捷，当您只扩增几个感兴趣的基因时，可轻松处理多个 RNA 样品（尤其是使用液体处理机器人时）。因此，它是高通量筛选实验室的理想选择，因为在这种实验室中，只需使用既定的反应条件重复进行几次反转录 qPCR 检测，而且还能在同一 RNA 样品的单孔中完成相关基因和对照基因的多重 qPCR 检测。
使用一步式 RT-PCR 混合液有哪些注意事项？
基因特异性引物需要在一个试管中生成 cDNA 并进行后续扩增，但这减少了实验差异，因为两个酶反应都是在相同条件下进行的，这使得一步式 qPCR 具有很高的可重复性。
一步式 RT-PCR 需要仔细评估，以防止引物二聚体的形成，因为在 RT 反应和 qPCR 循环的低温条件下引物都会存在。这一点在多重 qPCR 检测中尤为重要。
如何在 RT-qPCR 中使用尿嘧啶 DNA 糖基化酶？
qPCR 污染包括来自其他样本的交叉污染、来自实验室其他地方的污染以及来自先前 qPCR 实验中使用的扩增产物和引物的携带污染。后者是导致 qPCR 出现假阳性结果的主要原因。防止污染很困难，因此必须制定实验室程序，确保一次检测的 DNA 不会在后续检测中再次扩增。
Uracil DNA 糖基化酶可特异性地降解已通过 qPCR 过程并含有 dUTP 的产物，使用于扩增的原生核酸模板保持完整。Uracil DNA 糖基化酶的激活是 qPCR 的第一步，在 50°C 孵育 2 分钟，然后在热启动激活过程中温度升至 95°C 时 Uracil DNA 糖基化酶就会变性。
UDG 和 UNG 有什么区别？
尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG 或 UDGase）是由六个亚家族组成的酶家族。家族 I 的 UDGase 酶被称为 UNG（尿嘧啶-N-糖基化酶基因），因此没有区别，UDG 和 UNG 这两个词通常可以互换使用，因为它们在 qPCR 中具有相同的功能，即防止携带 qPCR 污染。
我是否应该在 RT-qPCR 中加入 No-RT 对照反应？
No-RT 对照反应可用于确定扩增样本中可能存在的基因组 DNA 时可能出现的问题。但是，许多 RNA 转录本的丰度较低，对于这些转录本，如果引物组不跨越外显子-外显子连接，建议进行 No-RT 对照反应。如果引物确实跨越了外显子连接，或者基因组 DNA 不可能干扰（例如在检测样本中的 RNA 病毒时），则不需要进行 No-RT 对照。
冻干混合物在环境温度下能稳定多长时间？
Lyo-Ready™ 1-Step RT-qPCR 病毒混合物在有引物和探针或没有引物和探针的情况下冻干后，在环境温度（17 – 23 °C）下至少可稳定保存 24 个月。重新水化后，检测的重现性、灵敏度和稳健性将与新制成的液体混合物相同，使混合物成为床旁分子诊断检测和微流控 qPCR 设备的理想选择。
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